Pertumbuhan Mikroba, Kinetika, Perhitungan, Populasi, Kultur, Rumus, Fase, Metode, Faktor

Artikel dan Makalah tentang Pertumbuhan Mikroba, Kinetika, Perhitungan, Populasi, Kultur, Rumus, Fase, Metode, Faktor - Pertumbuhan dapat didefinisikan sebagai pertambahan jumlah atau volume serta ukuran sel. Pada organisme prokariot seperti bakteri, pertumbuhan merupakan pertambahan volume dan ukuran sel dan juga sebagai pertambahan jumlah sel. Pada jasad bersel banyak (multiseluler), pembelahan sel tidak menghasilkan pertambahan jumlah individunya, tetapi hanya merupakan pembentukan jaringan atau bertambah besar jasadnya.

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Pertumbuhan mikroba dapat dibedakan antara pertumbuhan masing-masing individu sel dan pertumbuhan kelompok sel atau pertumbuhan populasi. Pertumbuhan tersebut dapat diukur secara langsung maupun tidak langsung. Pengukuran langsung akan diperoleh jumlah keseluruhan mikrobia, baik yang hidup maupun yang mati, sedangkan pengukuran tidak langsung hanya menghitung mikrobia yang hidup. Pengukuran langsung dilakukan secara mikroskopis yaitu dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Alat yang digunakan adalah Petroff-Hauser Chamber atau Haemocytometer. Pengukuran tidak langsung dapat dilakukan dengan metode plate count, MPN maupun dengan pengukuran turbiditas dengan menggunakan spektrofotometer.

Kinetika pertumbuhan populasi mikroba dapat dilihat berdasarkan sistem biakannya yaitu pada biakan sistem tertutup (batch culture) dan biakan sistem terbuka (continous culture). Pada biakan sistem tertutup, pengamatan pertumbuhan populasi mikrobia dalam waktu yang cukup lama memberikan gambaran melalui kurva pertumbuhan, terdapat fase-fase pertumbuhan. Pertumbuhan sel bakteri biasanya mengikuti suatu pola pertumbuhan tertentu berupa kurva pertumbuhan sigmoid. Fase pertumbuhan dimulai pada fase log, fase eksponensial, fase stasioner, dan fase kematian.

Sistem biakan terbuka digunakan untuk mempertahankan sel pada fase pertumbuhan eksponensial. Sistem biakan terbuka mempunyai ciri berupa ukuran populasi dan kecepatan pertumbuhan dapat diatur pada nilai konstan menggunakan khemostat. Khemostat digunakan dengan mengatur kecepatan aliran medium dan kadar substrat (nutrien pembatas). Nutrien pembatas dapat menggunakan sumber C (karbon), sumber N atau faktor tumbuh.

Pertumbuhan mikrobia tidak lepas dari pengaruh faktor-faktor lingkungan. Perubahan lingkungan dapat mengakibatkan perubahan sifat morfologi dan fisiologi mikrobia. Beberapa kelompok mikrobia sangat resisten terhadap perubahan faktor lingkungan. Mikrobia tersebut dapat dengan cepat menyesuaikan diri dengan kondisi baru tersebut. Faktor lingkungan meliputi faktor-faktor abiotik (fisika dan kimia), dan faktor biotik. Oleh karena itu bahasan mengenai kinetika pertumbuhan serta faktor-faktor yang berpengaruh terhadap pertumbuhan perlu dikaji lebih lanjut.

1.2. Tujuan

Penulisan yang membahas tentang tema kinetika pertumbuhan mikrobia bertujuan untuk:

1. Menjelaskan dan menggambarkan bentuk kinetika pertumbuhan populasi mikroba pada batch culture dan continuous culture.
2. Menjelaskan cara penghitungan pertumbuhan populasi mikroba.
3. Mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi kinetika pertumbuhan mikroba.

BAB II

ISI

2.1. Kinetika Pertumbuhan Mikroba  

Kinetika pertumbuhan mikroba digunakan untuk menggambarkan sifat-sifat pertumbuhan mikroorganisme. Sifat pertumbuhan mikrobia dapat digambarkan dalam bentuk kurva pertumbuhan populasi mikroba yang ditumbuhkan dalam batch culture atau continuous culture.

2.2. Kinetika Pertumbuhan Mikroba dalam Batch Culture

Penumbuhan mikroba dalam sistem batch culture merupakan sistem kultur tertutup (menggunakan tabung reaksi atau flask) tanpa adanya penambahan medium baru ke dalam kultur. Mikrobia dalam sistem tertutup mengalami 4 fase pertumbuhan, secara berurutan meliputi fase lag, fase eksponensial, fase stasioner dan fase kematian. Pertumbuhan mikrobia dalam sistem tertutup menyebabkan fase eksponensial mikrobia sangat terbatas (Brock, 2012). Tipe pertumbuhan mikrobia dalam batch culture dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Kurva Pertumbuhan Populasi Mikroba dalam Batch Culture.

Pada Gambar 1 menggambarkan jumlah berat kering sel mikroba (dalam bentuk log) yang ditumbuhkan dalam periode inkubasi (waktu) tertentu. Mikroba akan mengalami fase pertumbuhan populasi berdasarkan laju peningkatan jumlah individu mikroba selama waktu tertentu (Scragg, 1988).

a. Fase Lag

Fase lag merupakan waktu yang dibutuhkan mikrobia untuk tumbuh beradaptasi di dalam medium baru. Adaptasi mikrobia dilakukan untuk mensintesis enzim-enzim yang dibutuhkan untuk pertumbuhan lebih lanjut. Pada fase lag terjadi pertambahan massa dan volume sel mikrobia. Panjang atau pendeknya interval fase lag tergantung pada jenis inokulum mikrobia, medium yang sedikit nutrisi dan kondisi pertumbuhan mikrobia saat diinokulasikan.

Ada 3 alasan mikrobia kembali ke fase lag, yaitu:

1. Inokulum hidup yang digunakan berasal dari kultur medium lama (saat mikrobia dalam fase stasioner) dipindahkan ke dalam komposisi medium baru yang sama. Keadaan mikrobia kembali ke fase lag karena mikrobia sudah tidak memiliki metabolit penting untuk menunjang kehidupannya. Oleh karena itu, mikrobia membutuhkan rentang waktu untuk melakukan biosintesis kembali. Mikrobia yang diinokulasikan mengalami kerusakan sel (tidak mati) akibat perubahan suhu, radiasi atau bahan kimia toxic. Fase lag dibutuhkan mikrobia untuk memperbaiki kerusakan sel nya.
2. Populasi mikrobia yang diinokulasikan berasal dari medium kaya nutrisi dipindahkan ke dalam medium yang sedikit nutrisinya. Mikrobia membutuhkan waktu untuk menghasilkan enzim baru yang digunakan untuk mensintesis metabolit essensial.
3. Populasi mikrobia tidak akan mengalami fase lag jika inokulum yang digunakan berasal dari populasi mikrobia yang mengalami pertumbuhan fase eksponensial dan ditumbuhakan pada kondisi medium yang sama (Brock, 2012).

b. Fase Eksponensial

Pada fase eksponensial, populasi mikrobia mengalami pembelahan paling tinggi dan konstan dalam waktu generasi yang pendek. Waktu generasi mikrobia merupakan waktu yang dibutuhkan sel mikrobia untuk membelah menjadi 2 sel. Setiap sel mikrobia akan membelah 2x lipat sehingga peningkatan jumlah populasi selalu 2n, n adalah jumlah generasi. Pertambahan jumlah sel dalam populasi disebut sebagai pertumbuhan mikrobia.

Pada fase eksponensial, awalnya sel mikrobia membelah secara pelan kemudian penambahannya semakin meningkat cepat. Secara matematis memiliki rumus:

Nt  = N₀2ⁿ                 (1)

Nt  : jumlah sel setelah tumbuh selama waktu t

t : waktu pertumbuhan selama fase eksponensial

N₀: jumlah sel mula-mula selama fase eksponensial

2  : bilangan tetap (pembelahan biner)

n : jumlah generasi (pembelahan)

Berikut contoh pertambahan populasi mikrobia yang dapat di lihat pada Gambar 2.

Gambar 2. Pertumbuhan Eksponensial Populasi Mikrobia, A. contoh penggandaan sel mikrobia yang membelah setiap 20 menit, B. grafik penggandaan sel mikrobia, garis merah dalam skala Aritmetik dan garis biru dalam skala Logaritmik. (Dikutip dari Prescott, 1999: 115)

Skala logaritmik menunjukkan jumlah sel dan skala aritmetik menunjukkan waktu inkubasi. Titik perpotongan antara skala logaritmik dengan skala aritmetik menunjukkan adanya pertumbuhan eksponensial dan populasi mengalami penggandaan dalam interval waktu konstan. Penghitungan waktu generasi dapat digunakan rumus berikut:

Nt  = N₀2ⁿ

log Nt = log N₀ + n log 2

log Nt – log N₀ = n log 2

n   = log Nt – log N₀ = log Nt – log N₀                         (2)

        ——————    ——————

        log 2                     0.301

menggunakan rumus tersebut maka dapat di cari nilai n. Waktu generasi (g) pada pertumbuhan ekponensial diperoleh dari:

g = t/n                                                  (3)

di mana t adalah waktu pertumbuhan (dalam hari/jam/menit).

Rerata pertumbuhan dalam batch culture dapat dinyatakan dalam bentuk konstanta kecepatan pertumbuhan rerata (k).

k = n/t

k = log Nt – log N₀

——————-

      0.301(t)

Jika populasi mengganda maka t = g

= log (2N₀) – log N₀

———————–

    0.301 (g)

= log 2 + log N₀ – log N₀

—————————-

   0.301 (g)

k  = 1/g                                                (4)

g  = 1/k                                                (5)

(waktu generasi berbanding terbalik dengan kecepatan pertumbuhan rerata) (Prescott, 1999).

Rata-rata kecepatan pertumbuhan pada fase eksponensial sangat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan (seperti nutrisi, kondisi inkubasi), seperti halnya karakteristik genetik suatu mikrobia. Pada umumnya, prokariot lebih cepat tumbuh daripada eukariot dan eukariot yang berukuran kecil lebih cepat tumbuh daripada yang ukurannya lebih besar. Hal ini karena sel yang berukuran kecil memiliki kapasitas penyerapan nutrisi dan pembuangan sisa metabolisme lebih besar daripada sel yang berukuran besar. Kondisi tersebut mempercepat proses metabolisme yang akan mempengaruhi kecepatan pertumbuhan mikrobia. Pertumbuhan yang lebih cepat pada prokariot (bakteri) menyebabkan waktu generasinya lebih pendek dibandingkan eukariot (Brock, 2012).

Biomassa sel mikrobia dapat dihitung melalui konstanta kecepatan pertumbuhan spesifik (µ), berikut:

dX / dt = µX                             (1)

dX       : perubahan biomassa selama waktu dt

dt        : perubahan waktu

X         : biomassa sel (jumlah sel/komponen sel spesifik (protein))

µ         : konstanta kecepatan pertumbuhan

dalam bentuk logaritma dengan bilangan dasar e, maka:

Xt / t   = µX₀

µ (t)   = Xt / X₀

µ         = (ln Xt – ln X₀) / t

µ(t)    = ln Xt – ln X₀

ln Xt  = µ(t) + ln X₀                            (2)

Xt       = Xo (e µt)           (dalam bentuk antilogaritma)              (3)

Kerapatan populasi dalam t dapat diperkirakan dengan µ sebagai konstanta pertumbuhan. Parameter untuk konstanta pertumbuhan populasi secara eksponensial adalah waktu generasi (waktu penggandaan). Penggandaan populasi terjadi saat Xt/Xo = 2, sehingga rumus menjadi :

Xt           =  X₀ (e µt)        (dalam bentuk antilogaritma)

Xt / X₀   =  e µt

2             =  e µt

ln 2        = ln e µt

0,693   = µt                 (t=g)

0,693 = µg                                                     (5)

0,693 = µ (1/k)

µ          = 0,693 k                                             (6)

Xt        : jumlah sel setelah t

X₀       : jumlah sel awal

t           : waktu pertumbuhan diamati

μ dan k, keduanya menggambarkan proses pertumbuhan yang sama dari peningkatan populasi secara eksponensial. Perbedaannya μ merupakan konstanta kecepatan pertumbuhan yang digunakan untuk memperkirakan kecepatan pertumbuhan populasi dari masing-masing aktivitas sel individual dan dapat digunakan untuk mengetahui dinamika pertumbuhan secara teoritis, sedang k adalah nilai rata-rata populasi pada periode waktu terbatas, yang menggambarkan asumsi rata-rata pertumbuhan populasi.

c. Fase Stasioner

Mikrobia mengalami pertumbuhan yang terbatas dan konstan selama fase stasioner. Pada fase stasioner, pembelahan sel yang terjadi sangat lambat. Jumlah pembelahan sel dengan sel yang mati seimbang, sehingga jumlah sel relatif konstan (pertumbuhan 0). Pertambahan jumlah sel yang sebanding dengan kematian sel disebut dengan fenomena pertumbuhan kriptik.

Pada fase ini, sel mikroba tetap aktif melakukan metabolisme energi dan proses biosintesis lainnya. Metabolit sekunder banyak dihasilkan mikrobia pada fase ini. Fase stasioner terjadi karena beberapa alasan yaitu:

1. Terbatasnya nutrisi essensial dalam kultur yang mulai berkurang,
2. Bagi organisme aerobik, ketersediaan O2 dalam medium mulai berkurang,
3. Banyaknya sisa metabolisme yang tertimbun dalam medium kultur sehingga pertumbuhan mikroba terhambat (Brock, 2012 dan  Prescott, 1999).

4. Fase Kematian

Fase kematian terjadi jika terjadi perubahan lingkungan menjadi tidak menguntungkan, seperti berkurangnya nutrisi essensial dalam medium dan meningkatnya akumulasi zat toksik dalam medium. Grafik fase kematian seperti grafik fase eksponensial yaitu logaritmik (kematian sel tiap jam adalah konstan). Sel mikrobia yang mati akan mengalami lisis (Prescott, 1999).

2.3. Kinetika Pertumbuhan Mikroba dalam Continuous Culture

Dalam kultivasi mikroba menggunakan teknik continuous culture, mikroba ditumbuhkan secara terus menerus pada fase paling optimum untuk fase pertumbuhan yaitu fase eksponensial dimana sel membelah diri dengan laju yang konstan, massa menjadi dua kali lipat mengikuti kurva logaritmik. Hal ini dilakukan dengan memberi nutrisi secara terus menerus sehingga mikroba tidak pernah kekurangan nutrisi. Penambahan nutrisi/media segar ke dalam bioreaktor dilakukan secara kontinyu, dimana dalam waktu yang sama larutan yang berisi sel dan hasil produk hasil metabolisme dikeluarkan dari media dengan volume yang sama dengan substrat yang diberikan. Kondisi tersebut menghasilkan keadaan yang stedy state dimana pembentukan sel-sel baru sama dengan sel-sel yang dikeluarkan dari fermentor. Pada kondisi steady state konsentrasi nutrisi, konsentrasi sel, laju pertumbuhan dan konsentrasi produk tidak berubah walaupun waktu fermentasi makin lama. Laju pertumbuhan spesifik dipengaruhi oleh perbandingan antara laju aliran medium dan volume kultur disebut dengan “Laju Dilusi (D)” dimana

D = F/V

Keterangan:

F : Laju aliran

V : Volume

D : Laju dilusi

Dengan menggunakan continuous culture, sel mikroba atau produk metabolitnya dapat dipanen secara kontinyu. Continuous culture cocok untuk diterapkan pada sistem produksi metabolit sel mikroba yang tidak berpengaruh pada pertumbuhan selnya itu sendiri. Untuk industri bioteknologi berkapasitas besar, continuous culture menghasilkan efisiensi produksi yang lebih tinggi dibandingkan dengan batch culture asalkan produk yang dihasilkan tidak berpengaruh negatif terhadap mikroba penghasilnya. 

Gambar 3. Teknik continuous culture.

Continuous culture memiliki beberapa kelebihan sebagai berikut:

1. Produktivitas lebih tinggi, disebabkan lebih sedikit waktu persiapan bioreaktor persatuan produk yang dihasilkan, laju pertumbuhan & konsentrasi sel dapat dikontrol, pemasokan oksigen dan pembuangan panas dapat diatur, dengan demikian hanya butuh pabrik lebih kecil (pengurangan biaya  modal untuk fasilitas baru). 
2. Dapat dijalankan pada waktu yang lama. 
3. Cocok untuk proses yang kontaminasinya rendah dan produk yang berasosiasi dengan pertumbuhan. 
4. Pemantauan dan pengendalian proses lebih sederhana. 
5. Tidak ada akumulasi produk yang menghambat.

Kekurangannnya antara lain: aliran umpan yang lama, resiko kontaminasi besar (operasi harus hati-hati & desain peralatan lebih baik), peralatan untuk operasi dan pengendalian proses harus biasa tetap bekerja baik untuk waktu yang lama, memerlukan mikroba dengan kestabilan genetik tinggi, karena akan digunakan pada waktu yang lama (Irianto, 2007).

Pemberian nutrient secara kontinyu dan untuk mempertahankan keadaan steady state dalam teknik kultivasi ini dapat dilakukan dengan dua macam cara, yaitu: khemostat dan turbidostat.

a. Khemostat

Teknik continuous culture dengan menggunakan kemostat dilakukan dengan menambahkan nutrien melalui sebuah tangki sedemikian rupa sehingga komposisi nutrient di dalam fermentor tempat kultivasi mikrobia selalu dalam keadaan tetap. Hal ini dapat dicapai dengan mengatur kecepatan aliran medium baru ke dalam fermentor disesuaikan dengan aliran medium keluar fermentor untuk di panen.

Di dalam sistem ini sel dapat dipertahankan terus menerus pada fase pertumbuhan eksponensial atau fase pertumbuhan logaritma. Continuous culture mempunyai ciri  ukuran populasi dan kecepatan pertumbuhan dapat diatur pada nilai konstan  menggunakan khemostat. Untuk mengatur proses di dalam khemostat, diatur kecepatan aliran medium dan kadar substrat (nutrien pembatas). Sebagai nutrien pembatas dapat menggunakan sumber C (karbon), sumber N atau faktor tumbuh. Pada sistem ini , ada aliran keluar untuk mempertahankan volume biakan dalam kemostat sehingga tetap konstan (Scragg, 1988):

Dengan sistem ini, sel seolah-olah dibuat dalam keadaan setengah kelaparan, dengan nutrien pembatas. Kadar nutrien yang rendah menyebabkan kecepatan pertumbuhan berbanding lurus dengan kadar nutrien atau substrat tersebut.

1. Hubungan laju dilusi dengan konsentrasi sel

Sifat-sifat kemostat dan  pertumbuhan steady-state dapat ditunjukkan dengan sejumlah rumus yang berhubungan dengan jumlah sel dan konsentrasi nutrien pembatas terhadap laju alir suplai medium sebagai faktor yang beroperasi secara independen. Hal ini dilakukan dengan menjaga keseimbangan materi dan pembatasan substrat dalam bioreaktor (Scragg, 1988).

Akumulasi sel = sel masuk – sel keluar + pertumbuhan – kematian

Keterangan :

F  = laju alir suplai medium (1.h^-1);

V  = konstanta volume reaktor yang bekerja (1);

X₀ = konsentrasi  sel dalam medium suplai (g.1-1);

X    = konsentrasi sel dalam reaktor

µ    = laju petumbuhan spesifik

α    = laju kematian spesifik

Gambar 4. Kultur mikroba dalam Kemostat.

Dengan kemostat single-stage, suplai medium biasanya bersifat steril (dengan asumsi tanpa penggunaan kembali sel sebelumnya) dan µ > α, sehingga persamaannya dapat disederhanakan menjadi:

dimana F/V diistalahkan sebagai laju dilusi, D, yang merupakan jumlah volume kultur yang melewati reaktor setiap jam, sehingga persamaannya dapat ditulis ulang sebagai berikut:

Selama pertumbuhan steady state, dX / dt = 0, maka μ = D.

2. Hubungan antara konsentrasi substrat dan laju pertumbuhan

Monod adalah orang pertama yang mengkaji pengaruh konsentrasi substrat tehadap laju pertumbuhan.  Beliau menemukan bahwa ketika medium segar, yang mengandung glukosa sebagai sumber karbon sekaligus sebagai sumber energi dan dengan semua nutrien yang terkandung di dalamnya, diinokulasikan, siklus pertumbuhan kembali berjalan.

Hubungan antara laju pertumbuhan spesifik (μ) dan konsentrasi substrat (S) dapat digambarkan dengan kurva (Gambar 4) yang mirip demgam yang  penggambaran kinetika enzim model Michaelis-Menten. Monod mengajukan suatu aturan yang dikenal sebagai rumus Monod, untuk menggambarkan kurva tersebut.

μmax      : kecepatan pertumbuhan pada keadaan nutrien berlebihan

S                : kadar residu substrat pembatas

Ks              : kadar substrat pada saat μ = ½ μmax = konstanta satursi

Gambar 5. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kecepatan pertumbuhan spesifik.

Persamaan monod dapat dibuat persamaan garis lurusnya dengan pembalikan sebagai berikut:

Perpotongan antara  1/µ dengan 1/S menghasilkan garis lurus dengan slope Ks/µm, menangkap titik absis dari -1/Ks dan ordinat µm (Gambar 5).

3. Hubungan antara kecepatan pertumbuhan dan kecepatan penghasilan produk dengan kecepatan penggunaan substrat

Biomassa (Yx/s)dan hasil produk (Yp/s) merupakan parameter yang penting selama keduanya menunjukkan efesiensi penggunaan substrat dalam biomassa dan produk. Keduanya ditetapkan sebagai berat biomassa dan berat produk yang dibentuk per unit dari substrat yang digunakan.

dan

dimana:

Yx      : berat biomassa sel

Yp       : berat produk

dX/dt : kecepatan Pertumbuhan

dP/dt  : kecepatan penghasilan produk

dS/dt  : kecepatan Penggunaan substrat

Jika  μ = D → dX/dt = 0 (D< Dc)         Dc: D critical

Dc =  (μmaks x So)/(Ks + S₀)

Gambar 6. Perpotongan Double Reciprocal antara 1/μ dan [1/S].

b. Turbidostat

Teknik kultivasi dengan sistem turbidostat dilakukan dengan menambahkan nutrient secara kontinyu sehingga kerapatan sel selalu dalam keadaan tetap. Dalam teknik turbidostat, aliran medium diatur berdasarkan atas kerapatan optik kultur mikrobia. Pertumbuhan konsentrasi sel dipertahankan konstan dengan cara memonitor kekeruhan kultur.

Sistem ini didasarkan pada kerapatan bakteri tertentu atau kekeruhan tertentu yang dipertahankan konstan. Ada perbedaan mendasar antara biak statik klasik dengan biak sinambung dalam kemostat biak static arus dilihat sebagai sistem tertutup (boleh disamakan dengan organisme sial, tahap stationer dan tahap kematian. Kalau pada biak sinambung merupakan sistem terbuka yang mengupayakan keseimbangan aliran untuk organisme selalu terdapat kondisi lingkungan yang sama.

Dalam pertumbuhan sinkron akan terjadi sinkronisasi pembelahan sel. Hal ini dimaksudkan agar proses metabolisme siklus pembelahan bakteri dapat dipelajari diperlukan suspensi sel yang mengalami pembelahan sel dalam waktu sama yaitu sinkron. Sinkronisasi populasi sel dapat dicapai dengan berbagai tindakan buatan antara lain dengan merubah suhu rangsangan cahaya, pembatasan nutrien atau menyaring untuk memperoleh sel-sel yang sama ukurannya. Sinkronisasi pertumbuhan ini juga dimaksudkan untuk menyediakan stater dengan usia yang sama (Budiyanto, 2005).

Gambar 7. Kultur mikroba dalam Turbidostat.

Keterangan :

1. Reservoir of steril medium
2. Valve controling flow of medium
3. Outlet for spent medium
4. Foto sel
5. Sumber cahaya
6. Turbistat

Penggunaan Kultur Kontinyu Pada Industri adalah sebagai berikut :

1. Digunakan untuk penelitian fisiologi dan biokimia mikroba, dikarenakan kondisinya mantap, laju pertumbuhan dapat diatur oleh laju air dan laju pertumbuhan dibatasi oleh konsentrasi substrat pembatas, dapat digunakan untuk penelitian pengaruh substrat pembatas terhadap kinerja mikroba.
2. Untuk isolasi dan seleksi mikroba penghasil enzim menggunakan media diperkaya.
3. Untuk produksi biomassa, contoh ICI (Imperial Chemical Industries, kapasitas bioreaktor 3000 m3, substrat metanol).
4. Untuk produksi bir.

2.4. Teknik mengukur pertumbuhan populasi mikroba

a. Berdasarkan jumlah sel

b. Berdasarkan biomasa sel

c. Berdasarkan  aktivitas metabolisme

Uraian :

a. Berdasarkan jumlah sel

1. Metode langsung secara mikroskopis (Total count)

Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Enumerasi mikroba dapat dilakukan secara langsung yaitu dengan menghitung jumlahnya tanpa ditumbuhkan terlebih dahulu dalam suatu medium, dalam teknik ini semua sel mikroba baik yang hidup maupun yang mati akan terhitung. Untuk melakukan renumerasi mikroba dalam suatu bahan seringkali diperlukan pengenceran bertingkat.

a). Breed slide method

Pada metode ini tidak dibedakan sel yang hidup dan sel mati. Penghitungan dilakukan secara langsung pada setiap bidang pandang mikroskop. Sampel berupa cairan disebar (kira-kira 0,01 mL) pada microscope slide. Setelah dilakukan pewarnaan kemudian dilakukan penghitungan pada setiap bidang pandang mikroskop.

Gambar 8. Penghitungan melalui Breed slide method.

b). Petroff-Hauser chamber atau Haemositometer

Penghitungan secara langsung dapat dilakukan secara mikroskopis yaitu dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Alat yang digunakan adalah Petroff-Hauser Chamber atau Haemocytometer. Jumlah cairan yang terdapat antara coverglass dan alat ini mempunyai volume tertentu sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga tertentu. Dengan membuat preparat dari Suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber).

Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel nakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui.

Gambar 9. Petroff-Hauser chamber dan Haemositometer.

2. Metode tidak langsung (viable count)

Perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viable count). Metode perhitungan secara tidak langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni yang merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terdapat pada sampel. Cara ini adalah cara yang paling umum digunakan untuk menentukan jumlah mikroba yang masih hidup, berdasarkan jumlah koloni yang tumbuh. Teknik ini diawali dengan pengenceran sampel secara seri, dengan kelipatan 1 : 10. Masing-masing suspensi pengenceran ditanam dengan metode tuang (pour plate) atau sebar (spread plate). Bakteri akan bereproduksi pada medium agar dan membentuk koloni setelah 18-24 jam inkubasi. Untuk menghitung jumlah koloni dalam cawan petri dapat digunakan alat ’colony counter’ yang biasanya dilengkapi dengan pencatat elektronik.

a). Spread plate method

Metode sebar (spread plate) merupakan metode penghitungan mikrobia pada medium padat. Dalam metode spread plate ini, volume kultur yang disebar tidak lebih dari 0,1 ml pada agar plate dan diratakan menggunakan alat yang disebut glass spreader. Kemudian plate diinkubasi sampai terlihat koloni sehingga jumlah koloni mikrobia dapat dihitung.  Walaupun mikrobia tertanam dalam agar plate, namun hasilnya sama dengan metode pour plate.

Gambar 10. Keuntungan menggunakan metode spread plate daripada metode pour plate adalah kultur tidak pernah terpapar suhu 450 ^oC (suhu melelehnya agar).

b). Pour plate method

Metode pour plate adalah metode agar cair yang digunakan untuk inokulasi dalam petri dish. Volume kultur yang biasa digunakan 0,1-1,0 ml. Kultur mikrobia dimasukkan ke dalam petri dish menggunakan pipet steril, kemudian medium agar yang telah dilelehkan (± 45 ^oC  dituangkan ke dalam petri dish yang telah berisi kultur mikrobia. Selanjutnya dilakukan pemutaran petri dish agar kultur mikrobia dan medium agar bercampur dengan rata. Koloni mikrobia akan tumbuh dan tertanam di dalam medium, baik di permukaan atas maupun di bawah. Sehingga metode pour plate ini cocok untuk menumbuhkan mikrobia anaerob.

Gambar 11. Pour Plate Method.

c). MPN method

MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang ditanam dari sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah sampel atau diencerkan menurut tingkat seri tabungnya sehingga dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme yang diuji dalam nilai MPN/satuan volume atau massa sampel.

Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkaan frekuensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin “sering” tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin “jarang” tabung positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah yang menghasilkan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dengan probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya ke dalam media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Frekuensi positif (ya) atau negatif (tidak) ini menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan.

Asumsi yang diterapkan dalam metode MPN adalah :

1. Bakteri terdistribusi sempurna dalam sampel
2. Sel bakteri terpisah-pisah secara individual, tidak dalam bentuk rantai atau kumpulan (bakteri coliform termasuk E. coli terpisah sempurna tiap selnya dan tidak membentuk rantai).
3. Media yang dipilih telah sesuai untuk pertumbuhan bakteri target dalam suhu dan waktu inkubasi tertentu sehingga minimal satu sel hidup mampu menghasilkan tabung positif selama masa inkubasi tersebut.
4. Jumlah yang didapatkan menggambarkan bakteri yang hidup (viable) saja. Sel yang terluka dan tidak mampu menghasilkan tabung positif tidak akan terdeteksi.
5. MPN dinilai dari perkiraan unit tumbuh (Growth Unit / GU) seperti CFU (Colony Forming Unit), bukan dari sel individu. Meskipun begitu baik nilai CFU atau MPN dapat menggambarkan seberapa banyak sel individu yang tersebar dalam sampel. Metode MPN dirancang dan lebih cocok untuk diterapkan pada sampel yang memiliki konsentrasi <100/g atau ml. Oleh karena itu nilai MPN dari sampel yang memiliki populasi mikroorganisme yang tinggi umumnya tidak begitu menggambarkan jumlah mikroorganisme yang sebenarnya. Jika jumlah kombinasi tabung positif tidak sesuai dengan tabel maka sampel harus diuji ulang. Semakin banyak seri tabung maka semakin tinggi akurasinya tetapi juga akan mempertinggi biaya analisa.

E. Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroba

Pertumbuhan dan aktivitas mikrobia dipengaruhi oleh beberapa faktor lingkungan. Faktor-faktor tersebut dapat menjadi pembatas bagi kebutuhan hidup mikrobia. Jika mikrobia berada di lingkungan yang sesuai, maka pertumbuhannya juga optimum. Beberapa golongan mikrobia sangat sensitif terhadap perubahan lingkungan, sedangkan yang lain resisten terhadap perubahan tersebut. Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas mikrobia antara lain sebagai berikut:

a. Suhu

1. Suhu pertumbuhan mikroba

Pertumbuhan mikrobia memerlukan kisaran suhu tertentu. Kisaran suhu pertumbuhan dibagi menjadi suhu minimum, suhu optimum, dan suhu maksimum. Suhu minimum adalah suhu terendah tetapi mikrobia masih dapat hidup. Suhu optimum adalah suhu paling baik untuk pertumbuhan mikrobia. Suhu maksimum adalah suhu tertinggi untuk kehidupan mikrobia.

Berdasarkan kisaran suhu pertumbuhannya, mikrobia dapat dikelompokkan menjadi mikrobia psikrofil (kriofil), mesofil, dan termofil. Psikrofil adalah kelompok mikrobia yang dapat tumbuh pada suhu 0-30 ^oC dengan suhu optimum sekitar 15 ^oC  Mesofil adalah kelompok mikrobia pada umumnya, mempunyai suhu minimum 15 0C suhu optimum 25-37 ^oC dan suhu maksimum 45-55 ^oC  Mikrobia yang tahan hidup pada suhu tinggi dikelompokkan dalam mikrobia termofil. Mikrobia ini mempunyai membran sel yang mengandung lipida jenuh, sehingga titik didihnya tinggi. Selain itu dapat memproduksi protein termasuk enzim yang tidak terdenaturasi pada suhu tinggi. Di dalam DNA-nya mengandung guanin dan sitosin dalam jumlah yang relatif besar, sehingga molekul DNA tetap stabil pada suhu tinggi.

Kelompok ini mempunyai suhu minimum 40 ^oC  optimum pada suhu 55-60 ^oC dan suhu maksimum untuk pertumbuhannya 75 ^oC  Untuk mikrobia yang tidak tumbuh dibawah suhu 30 ^oC dan mempunyai suhu pertumbuhan optimum pada 60 ^oC  dikelompokkan kedalam mikrobia termofil obligat. Untuk mikrobia termofil yang dapat tumbuh dibawah suhu 30 ^oC  dimasukkan kelompok mikrobia termofil fakultatif. Bakteri yang hidup di dalam tanah dan air, umumnya bersifat mesofil, tetapi ada juga yang dapat hidup diatas 50 ^oC (termotoleran). Contoh bakteri termotoleran adalah Methylococcus capsulatus. Contoh bakteri termofil adalah Bacillus, Clostridium, Sulfolobus, dan bakteri pereduksi sulfat/sulfur. Bakteri yang hidup di laut (fototrof) dan bakteri besi (Gallionella) termasuk bakteri psikrofil.

Gambar 12. Suhu pertumbuhan berbagai jenis mikroba.

Apabila mikroba dihadapkan pada suhu tinggi diatas suhu maksimum, akan memberikan beberapa macam reaksi.

1. Titik kematian thermal, adalah suhu yang dapat memetikan spesies mikrobia dalam waktu 10 menit pada kondisi tertentu. 
2. Waktu kematian thermal, adalah waktu yang diperlukan untuk membunuh suatu spesies mikrobia pada suatu suhu yang tetap. Faktor-faktor yang mempengaruhi titik kematian thermal ialah waktu, suhu, kelembaban, spora, umur mikrobia, pH dan komposisi medium.

2. Suhu rendah

Apabila mikrobia dihadapkan pada suhu rendah dapat menyebabkan gangguan metabolisme. Skibat-akibatnya adalah :

1. Cold shock, adalah penurunan suhu yang tiba-tiba menyebabkan kematian bakteri, terutama pada bakteri muda atau pada fase logaritmik, 
2. Pembekuan (freezing), adalah rusaknya sel dengan adanya kristal es di dalam air intraseluler, 
3. Lyofilisasi, adalah proses pendinginan dibawah titik beku dalam keadaan vakum secara bertingkat. Proses ini dapat digunakan untuk mengawetkan mikrobia karena air protoplasma langsung diuapkan tanpa melalui fase cair (sublimasi).

b. Kandungan air (pengeringan)

Setiap mikrobia memerlukan kandungan air bebas tertentu untuk hidupnya, biasanya diukur dengan parameter aw (water activity) atau kelembaban relatif. Mikrobia umumnya dapat tumbuh pada aw 0,998-0,6. bakteri umumnya memerlukan aw 0,90-0,999. Mikrobia yang osmotoleran dapat hidup pada aw terendah (0,6) misalnya khamir Saccharomyces rouxii. Aspergillus glaucus dan jamur benang lain dapat tumbuh pada aw 0,8. Bakteri umumnya memerlukan aw atau kelembaban tinggi lebih dari 0,98, tetapi bakteri halofil hanya memerlukan aw 0,75. Mikrobia yang tahan kekeringan adalah yang dapat membentuk spora, konidia atau dapat membentuk kista. 

c. Tekanan Osmosis

Tekanan osmosis sangat erat hubungannya dengan kandungan air. Apabila mikrobia diletakkan pada larutan hipertonis, maka selnya akan mengalami plasmolisis, yaitu terkelupasnya membran sitoplasma dari dinding sel akibat mengkerutnya sitoplasma. Apabila diletakkan pada larutan hipotonis, maka sel mikrobia akan mengalami plasmoptisa, yaitu pecahnya sel karena cairan masuk ke dalam sel, sel membengkak dan akhirnya pecah. Berdasarkan tekanan osmosis yang diperlukan mikrobia dapat dikelompokkan menjadi:

1. Mikrobia Osmofil : tumbuh pada kadar gula tinggi, contoh beberapa jenis khamir, mampu tumbuh pada larutan gula dengan konsentrasi lebih dari 65 % wt/wt (aw = 0,94).
2. Mikrobia Halodurik : tahan (tidak mati) tetapi tidak dapat tumbuh pada kadar garam tinggi (30 %).
3. Mikrobia Halofil : dapat tumbuh pada kadar garam yang tinggi, contoh: bakteri yang termasuk Archaebacterium, misalnya Halobacterium.

d. Buffer

Buffer merupakan campuran garam monobasik dan dibasik, contoh adalah buffer fosfat anorganik dapat mempertahankan pH diatas 7,2. Cara kerja buffer adalah garam dibasik akan mengabsorbsi ion H⁺ dan garam monobasik akan bereaksi dengan ion OH^-.

Untuk menumbuhkan mikrobia pada media, memerlukan pH yang konstan, terutama pada mikrobia yang dapat menghasilkan asam oleh karena itu buffer diperlukan untuk mempertahankan pH pada kisaran tertentu yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroba.

e. Ion-ion lain

Logam berat seperti Hg, Ag, Cu, Au, dan Pb pada kadar rendah dapat bersifat meracuni (toksis) karena mempunyai daya oligodinamik, yaitu daya bunuh logam berat pada kadar rendah. Ion-ion lain seperti ion sulfat, tartrat, klorida, nitrat, dan benzoat dapat mengurangi pertumbuhan mikrobia tertentu dan sering digunakan dalam pengawetan makanan, senyawa lain misalnya asam benzoat, asam asetat, dan asam sorbat.

f. Listrik

Bila aliran listrik diberikan pada medium tumbuh mikroba akan menyebabkan:

1. Terjadinya elektrolisis pada medium pertumbuhan.
2. Menghasilkan panas yang dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba, sel mikroba dalam suspensi akan mengalami elektroforesis.
3. Menyebabkan terjadinya shock karena tekanan hidrolik listrik, kematian mikroba akibat shock terutama disebabkan oleh oksidasi.
4. Adanya radikal ion dari ionisasi radiasi dan terbentuknya ion logam dari elektroda juga menyebabkan kematian mikroba.

g. Radiasi

Bila mikrobia menerima paparan radiasi tertentu:

1. Menyebabkan ionisasi molekul-molekul di dalam protoplasma.
2. Merusak mikrobia yang tidak mempunyai pigmen fotosintesis.
3. Cahaya mempunyai pengaruh germisida.
4. Sinar X (0,005-1,0 Å , sinar ultra violet (4000-2950 Å , dan sinar radiasi lainnya dapat membunuh mikroba.
5. Apabila tingkat iradiasi yang diterima sel mikrobia rendah, maka dapat menyebabkan terjadinya mutasi pada mikroba.

h. Tegangan Muka

1. Tegangan muka mempengaruhi cairan sehingga permukaan cairan tersebut menyerupai membran yang elastis.
2. Perubahan tegangan muka dinding sel akan mempengaruhi pula permukaan protoplasma, akibatnya mempengaruhi pertumbuhan dan morfologi mikroba.
3. Zat-zat seperti sabun, deterjen, dan zat-zat pembasah (surfaktan) dapat mengurangi tegangan muka cairan/larutan.
4. Umumnya mikroba cocok pada tegangan muka yang relatif tinggi

i. Tekanan Hidrostatik

1. Umumnya tekanan 1 – 400 atm tidak mempengaruhi atau hanya sedikit mempengaruhi metabolisme dan pertumbuhan mikroba, tekanan hidrostatik yang lebih tinggi akan menghambat atau menghentikan pertumbuhan, karena dapat menghambat sintesis RNA, DNA, dan protein, serta mengganggu fungsi transport membran sel maupun mengurangi aktivitas berbagai macam enzim.
2. Tekanan diatas 100.000 pound/inchi² menyebabkan denaturasi protein, tetapi ada mikrobia yang tahan hidup pada tekanan tinggi (mikrobia barotoleran), dan yang tumbuh optimal pada tekanan tinggi sampai 16.000 pound/inchi² (mikroba barofilik), umumnya mikroba laut adalah barofilik atau barotoleran, contoh: bakteri Spirillum.

j. Getaran

Getaran mekanik dapat merusak dinding sel dan membran sel mikroba, dipakai untuk memperoleh ekstrak sel mikroba dengan cara menggerus sel-sel dengan menggunakan abrasif atau dengan cara pembekuan kemudian dicairkan berulang kali atau dengan getaran suara 100-10.000 kali/detik juga dapat digunakan untuk memecah sel mikroba.

Daftar Pustaka :

Adams, M.R. 2000. Food Microbiology. University of Surrey. Guildford. New York

Buckle,K.A., J.A. Davey, M.J. Eyles, A.D. Hocking, K.G. Newton, and E.J. Stuttard. 1989. Foodborne Microorganisms of Public Health Significance. 4ed.. AIFST (NSW Branch).Australia.

Budiyanto, MAK. 2005. Mikrobiologi Umum. Malang: Universitas Muhammadiyah Malang Press.

Irianto, Koes. 2007. Mikrobiologi. Bandung: Yrama Widya.

Lim,D. 1998. Microbiology, 2nd Edition. McGrow-hill book, New york.

Madigan, M. T., Martinko, J. M., Stahl, D. A., and Clark, D. P., 2013, Brock Biology of Microorganisms Thirteenth Edition, 

Mangunwidjaja, Djumali. 2006. Rekayasa Bioproses. Bandung: IPB Press.

Pelczar, M. J. dan E. C. S. Chan1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. UI Press, Jakarta.

Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti, Jakarta.

Zubaidah, Elok. 2006. mikrobiologi umum. Universitas Brawijaya. Malang.